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技術(shù)文章

參與PCR反應(yīng)的五種主要物質(zhì)分別是哪些?

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  PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應(yīng))是一種在體外特異性擴增靶DNA序列的的技術(shù),通過多個循環(huán)的變性、退火和延伸,能夠使微量的遺傳物質(zhì)在幾小時內(nèi)得到幾百萬倍的擴增。參與PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要為五種:引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。

1.引物

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物設(shè)計有3條基本原則:首先引物與模板的序列要緊密互補,其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu),再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯配)。

引物的選擇將決定PCR產(chǎn)物的大小、位置、以及擴增區(qū)域的Tm值這個和擴增物產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數(shù)。好的引物設(shè)計可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生,甚至在RNA-PCR中也能識別cDNA或基因組模板。引物設(shè)計也極大的影響擴增產(chǎn)量:若使用設(shè)計粗糙的引物,產(chǎn)物將很少甚至沒有;而使用正確設(shè)計的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應(yīng)指數(shù)期的產(chǎn)量理論值。當然,即使有了好的引物,依然需要進行反應(yīng)條件的優(yōu)化,比如調(diào)整Mg2+濃度,使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。對引物的設(shè)計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功,但遵循某些原則,則有助于引物的設(shè)計。

(1)引物長度

PCR特異性一般通過引物長度和退火溫度來控制。引物的長度一般為15-30bp,常用的是18~27bp,但不應(yīng)大于38bp。引物過短時會造成Tm值過低,在酶反應(yīng)溫度時不能與模板很好的配對;引物過長時又會造成Tm值過高,超過酶反應(yīng)的*適溫度,還會導致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng),而且合成長引物還會大大增加合成費用。

(2)引物堿基構(gòu)成

引物的G+C含量以40~60%為宜,過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng),上下游引物的GC含量不能相差太大。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下,50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度,有效啟動溫度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計引物的Tm值,則有效引物的Tm為55~80℃,其Tm值*好接近72℃以使復性條件*佳。引物中四種堿基的分布*好是隨機的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。

(3)引物二級結(jié)構(gòu)

引物二級結(jié)構(gòu)包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對于引物的3’末端形成的二聚體,應(yīng)控制其ΔG大于-5.0 kcal/mol或少于三個連續(xù)的堿基互補,因為此種情形的引物二聚體有進一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性,引物中間或5’端的要求可適當放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu),也以3’端或近3’端對引物-模板結(jié)合影響更大;影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外,與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3’末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。

(4)引物3’端序列

引物3’末端和模板的堿基*配對對于獲得好的結(jié)果是非常重要的,而引物3’末端*后5到6個核苷酸的錯配應(yīng)盡可能的少。如果3’末端的錯配過多,通過降低反應(yīng)的退火溫度來補償這種錯配不會有什么效果,反應(yīng)幾乎注定要失敗。

引物3’末端的另一個問題是防止一對引物內(nèi)的同源性。應(yīng)特別注意引物不能互補,尤其是在3’末端。引物間的互補將導致不想要的引物雙鏈體的出現(xiàn),這樣獲得的PCR產(chǎn)物其實是引物自身的擴增。這將會在引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間產(chǎn)生競爭PCR狀態(tài),從而影響擴增成功。

引物3’末端的穩(wěn)定性由引物3’末端的堿基組成決定,一般考慮末端5個堿基的ΔG。?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能,該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性,此值的大小對擴增有較大的影響。應(yīng)當選用3’端?G值較低(**值不超過9),負值大,則3’末端穩(wěn)定性高,擴增效率更高。引物的3’端的?G值過高,容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。

需要注意的是,如擴增編碼區(qū)域,引物3′端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第3位易發(fā)生簡并,會影響擴增特異性與效率。另外末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基,因此應(yīng)當避免在引物的3’端使用堿基A。

(5)引物的5′端

引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度,它對擴增特異性影響不大。因此,可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括:加酶切位點;標記生物素、熒光、Eu3+等;引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列;引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。對于引入一至兩個酶切位點,應(yīng)在后續(xù)方案設(shè)計完畢后確定,便于后期的克隆實驗,特別是在用于表達研究的目的基因的克隆工作中。

(6)引物的特異性

引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源,特別是與待擴增的模板DNA之間要沒有明顯的相似序列。

2.酶及其濃度

Taq DNA多聚酶是耐熱DNA聚合酶,是從水生棲熱菌(Thermus aquaticus)中分離的。Taq DNA聚合酶是一個單亞基,分子量為94 000 Da。具有5’-->3的聚合酶活力,5’-->3’的外切核酸酶活力,無3’-->5’的外切核酸酶活力,會在3’末端不依賴模板加入1個脫氧核苷酸(通常為A,故PCR產(chǎn)物克隆中有與之匹配的T載體),在體外實驗中,Taq DNA聚合酶的出錯率為10-4~10-5。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。

此酶具有以下特點:

(1)耐高溫,在70℃下反應(yīng)2小時后其殘留活性在90%以上,在93℃下反應(yīng)2小時后其殘留活性是仍能保持60%,而在95℃下反應(yīng)2小時后為原來的40%。

(2)在熱變性時不會被鈍化,故不必在擴增反應(yīng)的每輪循環(huán)完成后再加新酶。

(3)一般擴增的PCR產(chǎn)物長度可達2.0 kb,且特異性也較高。

PCR的廣泛應(yīng)用得益于此酶,目前各試劑公司中開發(fā)了多種類型的Taq酶,有用于長片段擴增的酶,擴增長度可達40kb;有在常溫條件下即可應(yīng)用的常溫PCR聚合酶;還有針對不同實驗對象的酶等。

一典型的PCR反應(yīng)約需的酶量為2.5u(總反應(yīng)體積為50ml時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

3.dNTP的質(zhì)量與濃度

dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應(yīng)配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris。HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0~7.5,小量分裝,-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50~200mmol/l,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低。

4.模板(靶基因)核酸

模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是:溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機溶劑(酚與氯仿抽)抽提除去蛋白質(zhì)和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸,該核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標本,可采用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接用于PCR擴增。

模板DNA投入量對于細菌基因組DNA一般在1~10ng/l,實驗中模板濃度常常需要優(yōu)化,一般可選擇幾個濃度梯度(濃度差以10倍為一個梯度)。在PCR反應(yīng)中,過高的模板投入量往往會導致PCR實驗的失敗。

5.Mg2+濃度
Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200mmol/l時,Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/l為宜。Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。一般廠商提供的Taq DNA聚合酶均有相應(yīng)的緩沖液,而Mg2+也已添加,如果特殊實驗應(yīng)采用無Mg2+的緩沖液,,在PCR反應(yīng)體系中添加一定量的Mg2+。



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